Кинетические закономерности УФ- и термопревращений молекул лактатдегидрогеназы в условиях различного микроокружения

Исследование кинетических параметров УФ- и термопревращений ключевых ферментов метаболических путей и, в частности лактатдегидрогеназы, необходимо для выявления молекулярных механизмов их функционирования в условиях воздействия физико-химических агентов, различного микроокружения, а также понимания сущности процессов, лежащих в основе адаптации биополимеров и их надмолекулярных комплексов к различным экологическим факторам.

При изучении структурно-функциональных свойств лактатдегидрогеназы скелетных мышц свиньи (ЛДГ), модифицированной воздействием температуры в диапазоне 4070 єС, установлено, что фермент стабилен в интервале температур 20-40°С. При 45°С происходит резкое снижение активности ЛДГ, которое можно рассматривать как кооперативный переход белка из нативного в денатурированное состояние. Выявлено, что процесс термоинактивации ЛДГ осуществляется в несколько последовательно протекающих стадий, характеризующихся значениями энергии активации 24,4; 151,1; 91,9; 33,0 кДж/моль для интервалов температур 4045, 4550, 5060, 6070°С соответственно. Зависимость величин константы скорости тепловой инактивации лактатдегидрогеназы от температуры в координатах Аррениуса в интервале 4560°С имеет вогнутую форму с изломом при 50°С, что подтверждает многостадийность процесса термоинактивации фермента.

Методами гель-хроматографии и спектрофотометрии установлено, что термоинактивация лактатдегидрогеназы в диапазоне 40-70°С обусловлена распадом олигомерной молекулы фермента на мономеры и последующей реассоциацией субъединиц белка.

Ранее нами была продемонстрирована принципиальная возможность участия синглетного кислорода в процессе УФ-модификации каталитической активности ЛДГ при фиксированной дозе облучения путем применения тушителя указанного активного интермедиата - азида натрия. С целью детализации механизма его протекторного действия исследован характер зависимости эффекта восстановления каталитической активности фермента в присутствии экзогенного протектора от дозы УФ-облучения (09 кДж/м²) и определены величины константы скорости фотоинактивации белка, являющиеся мерой его фоточувствительности. Экспоненциальный характер полученной зависимости остаточной ферментативной активности от дозы УФ-облучения свидетельствует об отсутствии процессов реактивации УФ-модифицированного белка. При введении в облучаемую систему азида натрия в концентрации 3,210^-3 моль/л происходило частичное восстановление ферментативной активности ЛДГ. Для количественного описания данного явления мы использовали константы фотоинактивации, рассчитанные по тангенсу угла наклона линейной анаморфозы исходной кривой доза-эффект в координатах [lnА/A_o; t], которые составили для ЛДГ в свободной форме - 5,3910^-4 1/с; ЛДГ + NaN₃ - 4,310^-4 1/с. Линеаризация исходной кинетической кривой позволяет отнести процесс фотоинактивации лактатдегидрогеназы к типу мономолекулярных реакций первого порядка и свидетельствует о том, что защитное действие фотопротектора проявляется в снижении количества модифицированных молекул белка пропорционально УФ-дозам.