Кинетико-термодинамические аспекты катализа полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами

В связи с развитием биохимической технологии исследование кинетико-термодинамических закономерностей катализа иммобилизованными ферментами, влияние носителя на локальную концентрацию компонентов ферментативного процесса, распределение субстрата между средой носителя и раствором приобретает особую значимость. В этой связи исследовали кинетико-термодинамические параметры реакции гидролиза крахмала и инулина иммобилизованными амилазами. Глюкоамилазу и инулазу иммобилизовали на ионитах Дуолит А368 PR и АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом. Содержание белка в иммобилизованных ферментах определяли модифицированным методом Лоури, каталитическую активность глюкоамилазы измеряли глюкозооксидазным методом, а инулазы-спектрофотометрическим методом при помощи резорцина. Для вычисления кинетических параметров ферментативных реакций использовали метод графов, так как зависимость каталитической активности свободных и иммобилизованных глюкоамилазы и инулазы от концентрации субстрата не соответствует уравнению Михаэлиса. Поэтому мы применяли уравнение скорости (V) ферментативной реакции

,

где V_R и V_T - скорости реакции гидролиза полисахаридов в состоянии молекулы фермента R и T соответственно; Q- конформационная функция.

Зависимость конформационной функции от концентрации субстрата выражали следующим аналитическим уравнением:

,

где n - число субъединиц в молекуле фермента, L₀ - константа конформационного перехода из состояние R в состояние Т, S - концентрация субстрата, и - константа Михаэлиса в состоянии R и T соответственно.

Показано, что L₀ ферментативной реакции гидролиза крахмала при иммобилизации глюкоамилазы уменьшается (6,69 и 2,1 для свободного и ковалентно связанного фермента соответственно). Для расчета термодинамических параметров ферметативнных реакций использовали уравнение Аррениуса в интегральной форме, изменение энтальпии (DH) определяли по тангенсу угла наклона прямой модифицированной диаграммы Аррениуса, DS рассчитывали по основному термодинамическому уравнению. Установлено, что при иммобилизации на ионитах Е_акт. увеличивается, что вполне согласуется с экспериментальными данными по изучению каталитической активности ковалентно связанных амилаз.

Иммобилизации приводит к увеличению и , что может быть связано с диффузионными затруднениями при подходе молекулы субстрата к функциональным группам активного центра иммобилизованного фермента, уменьшением числа степеней свободы третичной структуры, ответственной за каталитические свойства, а также изменением микроокружения полипептидной цепи за счет воздействия матрицы носителя.