Гианик Т.1 , Пасечник В.И., Иванов С.А.
Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова, 191881, Москва, Б. Пироговская, 2/6, Россия;
1 Университет им. Коменского, Братислава, Словакия
Успехи в создании биосенсоров на основе встроенных белков в липидные бислойные мембраны на металлических подложках (п-БЛМ) поставили перед биофизиками задачу регистрации и распознования протекания специфических химических реакций, характерных для данного вида субстрата.
Принцип действия таких биосенсоров основан на том, что при связывании субстрата меняется конформация белковой макромолекулы, и это изменение передается липидному бислою, изменения свойств которого регистрируются и несут информацию о специфическом взаимодействии белка с субстратом. Такие биосенсоры потенциально должны обладать высокой селективностью и чувствительностью.
Их достоинством является высокая стабильность; в биосенсорах, использующих п-БЛМ, как правило регистрируют ток через них. Величина тока изменяется, если к ферменту, встроенному в п-БЛМ, например, глюкозооксидазе, добавить субстрат - глюкозу.
Объектом наших исследований являются биосенсоры на основе п-БЛМ, у которых БЛМ сформирована на торце тонкого металлического провода из нержавеющей стали, покрытого тефлоновой изоляцией, погруженного в раствор электролита 0,1 M ТрисHCl + KCl (1:1).
Исследование электрохимических процессов на электроде с БЛМ, при протекании электрических токов со средними плотностями 10-7 - 10-4 А/см2 и при напряжениях на электроде сравнения -1.0 - +1.0 В не позволило достоверно определять конформации белковых молекул на основе анализа циклических вольт-амперных характеристик.
В качестве информационного сигнала для дальнейшего анализа предлагаются два независимых подхода: анализ флуктуаций электрического тока, протекающего через мембрану и флуктуации модуля упругости липидного бислоя на металлической подложке.
Изменение структуры липидного бислоя при связывании белков приводит к изменению спектра низкочастотных флуктуаций тока, которое может быть использовано для регистрации изменения состояния п-БЛМ. Анализируются особенности флуктуаций токов через мембраны в зависимости от состава липидов и встроенных белков.
На основании анализа гистограмм токов и их частотных спектров выделены три основных типа флуктуаций токов: 1) редко встречающиеся выбросы тока большой амплитуды и большой длительности; 2) малые флуктуации тока вблизи среднего значения, подчиняющиеся нормальному закону; 3) короткие импульсы тока большой амплитуды, выходящие на рамки нормального закона распределения. Одновременно для сравнения исследовались флуктуации тока через чистые металлические электроды.
Вторым альтернативным подходом является изучение спектра флуктуаций модуля упругости мембран при связывании липидного бислоя белками. Связывание липидного бислоя приводит к уменьшению коэффициента диффузии липидных молекул на металлической подложке и, как следствие, к увеличению абсолютной величины модуля упругости и изменению спектра его флуктуаций. Наибольший интерес представляет исследование зависимости модуля упругости п-БЛМ от частоты внешнего синусоидального сигнала, на которой производятся измерения.
Предложенный авторами подход позволяет создать избирательный и высокочувствительный биосенсор на основе бислойных липидных мембран на металлической подложке, в основе работы которого лежит принцип измерения физических характеристик мембран.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы "Коперникус" (код проекта CIPA-CT-94-0231).